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化学与成员科学高校

近日,化学化工学院鞠熀先教授研究组在质谱成像分析方面取得重大进展,相关成果“MALDI-MS
Patterning of Caspase Activities and Its Application in the Assessment
of Drug Resistance”于4月21日在线发表于Angew. Chem. Int. Ed., DOI:
10.1002/anie.201601096。该成果由14级博士生胡骏杰为第一作者,鞠熀先教授为通讯作者完成。

在国家自然科学基金委和中国科学院的大力支持下,中科院化学所活体分析化学院重点实验室的研究人员长期致力于动物组织质谱成像技术的研究,先后开发了系列小分子新基质(Anal.
Chem.
2012, 84化学与成员科学高校。, 465; Anal. Chem. 2012, 84, 10291; Anal.
Chem.
化学与成员科学高校。 化学与成员科学高校。2013化学与成员科学高校。, 85, 6646;),并对半脑缺血(化学与成员科学高校。化学与成员科学高校。Anal. Chem. 2014,
86, 10114)、肿瘤转移等生物模型小鼠(Anal. Chem. 2015, 87,
422)的脑、肾、脾等组织进行了分子组织学质谱成像研究。最近,研究人员发展了一种通用、免标记的直接质谱成像方法,快速检测并对小鼠体内的碳纳米管、石墨烯和碳量子点等碳纳米材料进行定量成像研究。相关结果发表在近期的《自然-纳米技术》(Nature
Nanotech
. 2015, 10, 176)杂志上。

报告题目:活体质谱与成像

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质谱技术由于高通量和免标记的优势,在酶活性分析中得到广泛关注。然而,由于生物样品的成分复杂,组分丰度的分布差异大,其应用常被复杂的样品前处理所限制。为简化繁琐的样品前处理和数据分析过程,鞠熀先教授研究组发展了质谱成像分析新技术,实现了对多种酶活性的便捷可视化分析。该工作首先需攻克质谱成像分析尤其是通常MALDI-MS检测存在的难题,大幅度提高质谱信号与信噪比,从而通过逐点扫描,获得清晰的质谱图像。该课题组以磷脂分子修饰多肽底物,利用具有两亲特性的磷脂分子保证其在疏水玻片表面的有序组装,构建模拟生物膜,从而增强MALDI芯片的表面生物相容性,以使分析对象酶更易接近其底物,大幅度提高了质谱信号;同时这一设计增加了酶反应产物的分子量,可以避免基质与生物样品中杂质的干扰,改善了检测信噪比与质谱分辨能力。他们以含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶家族(Caspase-1,
-2,
-3和-8)为模型,将相应多肽底物分别与磷脂骨架的分子连接并组装嵌插于疏水玻片表面,制备出用于酶活性检测的阵列芯片;在目标酶的作用下,底物被剪切产生质量位移,各酶的活性通过酶切产物的质荷比进行颜色编码,实现了多种酶活性的可视化与高通量定量检测。这一方法已成功用于细胞内水解酶家族的抑制剂筛选和化疗过程癌细胞中Caspases酶活性演化的监测,为耐药性细胞鉴别及抗癌药物筛选提供了有力工具,并可方便地扩展应用于其它酶系统,为探究更多过程中酶的作用机制提供了新途径。

碳纳米材料因为其独特的物理化学性质,在材料学领域具有非常广阔的应用前景。近年来,由于碳纳米材料在药物输送、光动力学治疗、组织工程以及生物成像等方面的重要价值,而成为生物医学研究领域的热点材料。但是有关碳纳米材料的生物效应及生物安全性问题目前依然存在争论,因此生物组织中的碳纳米材料的生物分布研究具有重要的实际价值,尤其是亚器官的生物分布成像研究,有助于揭示纳米材料与生物体之间的相互作用。但是目前为止,这方面研究仍缺乏实用有效的方法。

报 告 人:聂宗秀 研究员(中国科学院化学研究所)

10月21日消息,近日,美国威斯康星大学麦迪逊分校李灵军课题组在Nature
Communications杂志上发表了一篇题为“Nanosecond photochemically promoted
click chemistry for enhanced neuropeptide visualization and rapid
protein
labeling”的文章,通过开发纳秒级光化学点击反应,改善了复杂高盐体系中蛋白质质谱的检测灵敏度,同时可以对蛋白质表面活性氨基进行标记,从而实现快速原位蛋白质结构分析。文章第一作者是威斯康星大学麦迪逊分校李灵军课题组博士后李功玉,主要致力于新型原位蛋白质质谱技术开发及其在疾病相关蛋白质快速鉴定和结构分析中的应用研究。

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对于碳纳米材料的生物监测或成像,通常采用放射性同位素或荧光标记法,因费时费力且标记物有解离的可能而具有一定局限性。而免标记的光谱学方法又存在成像速度慢、发光信号弱、背景干扰强等缺点。质谱成像技术提供了一种同时获取生物样品形貌及其分子信息的检测手段,各个种类分子可以在10微米及以下的空间分辨率被独立的检测出来。这种技术属于内源性的“免标记”法,因为分子都有其固有质量,只要分子可以被离子化就可以被检测出来。在质谱成像中最常用的分子离子化方法是基质辅助激光解吸/电离,但需要有机基质(通常为被测物的10000倍)与目标样品共结晶并用激光照射。基质吸收激光辐射后被快速激发并蒸发,随后共结晶的样品被转移到气相环境,样品分子可以通过基质的电荷转移离子化。然而,没有人证实过MALDI质谱检测完整碳纳米材料的能力,因为很难找到与其共结晶的合适的基质。如果没有基质,完整的分析物就很难被释放到气相中。而且,碳纳米材料的巨大分子量也远远超出了质谱能够检测的质量范围。

报告时间:2018年5月29日 9:30

在系统生物学和生物化学研究中,基于质谱的定量蛋白质组学已经成为一项主要的研究工具,特别是近年来越来越多的蛋白质标记技术的开发正在与日俱增地改善直接从复杂生物样品中进行蛋白质完整鉴定和相对、绝对定量的可行性。蛋白质组学质谱技术和非变性质谱技术,是目前普遍认可的用于蛋白鉴定和蛋白结构研究的代表性技术。然而,蛋白质的鉴定分析和结构研究往往是在不同条件下完成。如何实现同步进行蛋白质的原位鉴定和快速结构研究是现阶段蛋白质质谱领域的一大难题和挑战。同时实现蛋白鉴定和结构研究可以增加质谱技术的可靠性和实用性,尤其是能够提供更有生物意义、更接近生物体系中实际情况的蛋白质结构-功能关系的信息。尽管质谱技术曾经多次获得诺贝尔奖,质谱技术的一大硬伤是质谱检测的条件和生物体系实际条件差异巨大,因为质谱毕竟检测的是气相离子,而真正的生物蛋白体系无一例外都是在溶液相起作用的。

图1. 质谱芯片的制备及Caspase酶活性的可视化分析原理

为了解决这个问题,研究人员放弃传统基质,发现并利用碳纳米材料在紫外激光解吸电离过程中产生的固有碳负离子簇(C2-C10)指纹信号,该质谱信号几乎不受任何生物分子的背景信号干扰。结合飞行时间质谱,同时实现了小鼠体内碳纳米材料的亚器官质谱成像和定量分析。该碳负离子簇质谱指纹信号的发现,克服了传统质谱方法无法直接检测纳米材料的难题,将质量信号窗口转移到了质谱灵敏度高的小分子质量范围。与传统的标记方法相比,该激光解吸电离质谱分析方法由于采用内源性的化学信号,避免了标记基团在活体循环过程中可能产生的解离、衰变或者失活。同时,与免标记的光谱方法相比还具有高信噪比、低背景干扰以及准确可靠的优点。

报告地点:创隆厅

与此同时,敞开式质谱技术是近些年来越来越重要的一种能够实现无需样品制备、实际样品直接快速检测的质谱方法。该技术最早是美国科学院院士、普渡大学化学系教授Graham
Cooks于2004年提出)。随后受到广泛关注,越来越多的研究人员对Ambient
MS感兴趣并做出了很多相关的技术突破,一个主要的核心策略是要快速清除目标物周边的生物基质,以达到质谱兼容的条件。然而,Ambient
MS
技术主要用于小分子的检测应用,在蛋白质大分子检测上则较难实现,主要受限于蛋白质在丰度和种类上的多样性。如何改进Ambient
MS技术使之可以同时实现蛋白质鉴定检测和结构研究也是目前质谱研究领域的一大热点。

鞠熀先教授研究组自2000年开始质谱研究,以解决实际问题为出发点,建立了海洛因及其代谢物的LC/MS分析方法及鼠药的GC/MS快速检测方法等。2010年后,随着生命分析化学国家重点实验室的建立与生命科学研究的需求,该研究组将纳米技术、化学衍生及化学生物学与传统质谱分析方法结合,通过功能化碳纳米角、磁性碳纳米管等纳米材料,提出低丰度生物小分子(Chem.
Eur. J., 2013, 19, 102-108)与蛋白(Nanoscale, 2014, 6,
3150-3156)的选择性富集手段,建立了无需另加基质的MALDI-MS检测方法。特别是,针对阻碍MALDI-MS定量分析的瓶颈,该课题组利用分子标记实现了MALDI定量(Anal.
Chem., 2014, 86, 8275-8280; Anal. Chem., 2015, 87,
4409-4414),并用于多肽和酶活性的定量检测,创造性地改变了传统认识,扩展了这一技术的应用范围。

研究人员证实并比较了碳纳米管、石墨烯和碳量子点的亚器官生物分布。研究发现,碳纳米管和碳量子点在肾中主要分布在外部的实质区域。而在脾组织中,这三种碳纳米材料主要分布在脾的红质区域,还发现在边缘区中碳纳米管的浓度最高。定量结果表明,尺寸较大的未修饰碳纳米管和石墨烯主要富集在肺组织中,而碳量子点主要停留在内皮网状系统丰富的肝和脾中。此外,还意外的发现碳量子点在小鼠器官中的超长清除时间。最后,将该方法拓展到小鼠肿瘤组织中药物负载的碳纳米管成像以及二硫化钼二维纳米材料的组织成像研究。

个人简介:

化学分离技术,包括微电泳,是复杂体系中蛋白质和多肽质谱检测的一项主要辅助策略。近年来,为了改善化学分离技术的效率和实用性,人们将分离的时间和空间都缩短到了微尺度甚至纳尺度级别。值得一提的是,近期一系列高水平杂志,Angew.
Chem. Int. Ed. 49, 2238–2241
)发表了关于光化学微电泳技术的文章,报道了该技术通过荧光标记之后用于核酸相互作用的相关研究。PME依赖于激光辐射一个光敏小分子NBA,产生自由基NS-和游离的质子并因此生成局部电场。核酸在这种局部的电场中迁移,不同状态下的核酸迁移速率有差异,从而实现对不同状态核酸的分离分析。此外,另外一种微分离技术,微热泳技术),基于温度梯度诱导的分子定向迁移,也被开发出来用于分离分析。

(化学化工学院 科学技术处)

这些重要的应用和发现,进一步表明该方法可以结合质谱成像和定量的优点,进行纳米材料与生物体系相互作用研究,并有望发展成为一种碳纳米材料乃至其它纳米材料生物分析的通用方法。论文发表后,Nature
Nanotechnology杂志专门邀请国际知名质谱学专家Richard W.
Vachet撰文在同期的“新闻视角”专栏评论:“这种成像技术提供了一种强大的活体定量纳米材料的方法,一个特别让人激动的优势是该方法可拓展同时检测纳米材料及其附近的蛋白质或其他生物分子,将深层次揭示生物分子和材料的相互作用。无论如何,活体纳米材料的质谱成像研究将有一个光明的未来”。详情请参阅Molecular
Histology: More than a picture, Nature Nanotech. 2015, 10,
103-104。

聂宗秀,中国科学院化学研究所研究员。2003年获中国科学院武汉物理与数学研究所博士学位。2005-2008年分别在台湾中央研究院原子分子科学研究所和美国普渡大学化学系博士后。2009年1月入选中科院“百人计划”计划,任中科院化学所研究员。2016年获国家基金委“杰青”。独立工作以来,发表通讯作者论文49篇,其中包括1篇Nature
Nanotech.、14篇Anal. Chem.、2篇Chem. Eur. J.、2篇Chem.
Commu.。发表在Nature
Nanotech.上的工作,由杂志社撰文在同期的“新闻视角”中进行了专栏评论,被Chem.
Res. Toxicol.选为“研究亮点”,入选2016年Nature
Nanotech.杂志10周年专刊。授权中国发明专利18项。

蛋白质的鉴定和定量其实更依赖于标记化学技术的开发和发展。因为几乎所有多肽和蛋白都带有高活性的氨基基团,目前定量蛋白质组学领域的标记试剂主要都是基于氨基的反应,包括市面上的TMT和iTRAQ。自从2010年开发报道DiLeu。)标记试剂以来,李灵军课题组长期致力于改善蛋白质组学定量标记试剂的持续开发,包括标记效率、成本和标记的通量。此外,近期有一些报道,通过结合标记试剂和基质辅助激光解吸附离子源MALDI,质谱结果表明这可以实现原位标记化学,大大节省了标记时间。

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基质辅助激光解吸电离质谱成为蛋白质组学、基因组学、代谢组学、醣体学、脂质组学,以及质谱成像等研究中不可或缺的工具。然而,由于传统基质在小分子区域的严重背景干扰,阻碍了MALDI对小分子化合物(m/z
<
1000)的质谱分析。近年来,我们一直致力于新型无背景干扰基质的研究,用于复杂生物体系中小分子化合物的质谱分析与成像,开发出了系列高耐盐性,低背景干扰的有机盐新基质。结合大鼠中动脉栓塞、结肠癌肝转移和肾纤维化等生理模型,实现了生物组织切片的质谱成像,原位检测了组织中非脂质小分子化合物和甘油磷脂的代谢变化和空间分布。此外,基于碳纳米材料低分子量区域的特征指纹质谱方法,获得了碳纳米管,碳纳米点,氧化石墨烯等碳纳米材料在生物组织以及组织亚器官中的分布,同时对其进行了定量质谱成像研究。研究发现,碳纳米管和碳纳米点主要分布于肾组织的外实质部分,所有材料在脾脏的红髓均有分布,碳纳米管在脾脏组织中的边缘区域浓度最高。

这种原位标记化学技术其实是一种典型的点击反应。点击化学反应广泛应用于化学生物和材料等各个领域,其中就包括蛋白质的生物交联。2018年,法国南特大学NantesGouin课题组在JACS上报道了一种基于蛋白质上酪氨酸的电化学点击反应,用于蛋白质的快速标记)。同一年,英国剑桥大学Gaunt课题组则在Nature上提出一种针对甲硫氨酸特异性的蛋白质标记点击反应)。

质谱成像揭示碳纳米材料的亚器官生物分布

图1.
纳秒光化学反应原理图及其在质谱直接检测时原位除基质和蛋白质快速标记两个研究方向的应用示意图

活体分析院重点实验室

基于以上原位标记技术,光化学微电泳和微热泳等技术,李灵军课题组开发出一种基于纳秒级光化学点击反应的敞开式质谱探针。这种探针不仅可以实现原位快速分离、去除干扰质谱检测的生物基质,还可以对高达155
kDa的大蛋白进行快速有效的高通量原位标记,从而达到根据表面暴露氨基数目的多少可以推断蛋白质结构的转变。作者使用了高分辨率质谱对这一系列光化学点击反应进行分子量水平的直接实时观测。

2015年3月19日

图2. 纳秒光化学反应增强神经肽的原位可视化表征

作者首先在多种复杂基质条件下验证了方法的可行性,通过对比质谱图中的非特异性小分子杂质结合峰的比例,以及对质谱检测多肽的灵敏度等角度,考察了该纳秒光化学策略在提高原位蛋白质质谱检测中的作用。在此基础上,作者进一步将该方法应用到质谱成像中,主要集中在提高神经肽的质谱成像灵敏度上。正如图2所示,该方法不仅能够维持高丰度高响应的磷脂质谱信号和成像质量,还可以大大增加相对丰度较低、质谱响应较差的神经肽在质谱成像时的鉴定数以及成像图谱的质量也大大提高。这得益于纳秒光化学反应原位消除了基质干扰,也能够促进质谱成像重构脑部微区结构,如果能够在大气压敞开式条件下实现激光单细胞单神经元成像,该方法将会更加大放异彩,有望实现进一步的突破,比如单细胞原位蛋白质质谱成像等。

除了提高原位蛋白质质谱的灵敏度,作者还发现该方法可以用于在线、原位、快速标记多肽和蛋白质。图3显示该方法可以适用于各种多肽的高效标记。同时,作者也对标记的位点进行了测定,采用的是碰撞诱导解离的二级质谱方法,结合多种潜在位点封端的对照实验,详细而完整地揭示了纳秒光化学反应用于多肽蛋白质标记的原理。

最后,作者还将该方法应用于分析蛋白质糖基化对其结构的影响。通过理论计算对比该方法标记的表面氨基个数发现,该纳米光化学方法可以成功探测到表面暴露度大约40%的活性氨基。而当蛋白质结构由于外界条件变化而完全变性时,该方法则可以几乎探测到所有的活性氨基基团。该纳秒光化学方法还揭示蛋白质表面的糖基化修饰可能会使一个糖蛋白结构趋于收紧,表面可接触的活性氨基数目低于表面无糖基化的对照组
。而这种糖基化的修饰在实际生物体系包括人体中是非常常见的,此前有报道老年痴呆症中的该类型糖基化有显著变化。值得注意的是,更为传统的结构质谱方法,离子迁移质谱并未能够成功检测出该糖基化对蛋白质结构的影响。这说明该纳秒光化学方法具有较高的结构探测灵敏度,未来可以用于更多的,基于MALDI-MS的蛋白质结构鉴定分析中。这也将拓展这一新型质谱技术的应用领域。

图3. 纳秒光化学反应用于多肽的高效标记

图4. 纳秒光化学反应用于大蛋白的标记和结构探测

背景

目前基于生物质谱的蛋白质组学及相关定量技术正在经历飞速发展,然而现阶段的蛋白质鉴定和蛋白质结构分析往往需要使用不同的分析平台单独进行。这不仅降低了质谱分析效率,而且很难保证蛋白质结构分析的时效性。

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